河南省苹果新病害

苹果是河南省的第一大水果，河南省每年因病虫为害造成的产量损失和贮藏烂果为70万—100万t。病虫害严重制约着河南苹果产业的发展。近年来，豫北部分地区的苹果树上发生了一种新的病害，其发病症状与刘开启、张勇等报道的山东地区苹果树和桃树上的叶枯病类似，表现为生长季节叶片腐烂，枝条枯死。为了明确该病的发病原因，为防治提供依据，2008年以来我们对该病进行了病菌分离、致病性测定和病原鉴定等研究。现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　供试菌株

在河南省濮阳市苹果栽培区采集发病的苹果枝条及叶片分离所得的菌株PYY、山东省果树研究所赠送的ALS(分离自梁山地区的发病苹果树)及PDX(分离自单县地区的发病桃树)菌株以及江苏省农业科学院植物保护研究所赠送的AGl标准菌株。

1.1.2　供试植物

致病性测定的寄主为河南省濮阳地区主栽的苹果树，品种包括富士、新红星和乔纳金。

1.1.3　供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)用马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂17 g、蒸馏水1 000 mL。水琼脂培养基用琼脂17 g、蒸馏水1 000 mL。

1.1.4　引物

真菌核糖体基因转录间隔区ITSl：(5’－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3’)／ITS4：(5’－TCCTCCGCTTATrGATATGC－3’)，由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.1.5　供试染色液

细胞核染色液——番红O－KOH染色液的配制：先用蒸馏水分别配制质量分数为O，5％的番红0溶液和质量分数为3％的KOH溶液，然后取0.5％番红0溶液6 mL、3％KOH溶液6 mL、甘油3 mL与蒸馏水85 mL混合后装于棕色滴瓶中备用。

1.2　方法

1.2.1　病原菌的分离与纯化

从发病的苹果叶片、病芽的病健交界处切取5 mm见方的小块，经75％酒精消毒并用无菌水冲洗干净后，用灭菌滤纸吸去水分，移植在PDA培养基平板上，培养、纯化。同时，在发病枝条上直接挑取菌核进行分离培养。将获得的菌株转接在斜面试管中，在4℃条件下保存。

1.2.2　病菌致病性测定

供试菌株PYY在PDA培养基上培养3天(25℃条件下)后，以直径为5 mm的打孔器打取茵饼以备接种。2009年7月下旬，在田间选取2年生苹果树的1年生枝条进行接种，对照和测定枝各接30个枝条。用蘸有75％酒精的棉球擦拭接种点，待酒精挥发后，无伤接种至树皮处，以无菌的PDA饼作为对照。接种点用蘸有无菌水的脱脂棉保湿，用透明胶带包裹接种点，接种枝条套塑料袋保湿，2天后去掉塑料袋，隔天观察发病状况。

1.2.3　病原茵的鉴定

(1)病原菌形态观察

将菌株接种在PDA培养基上，25℃条件下培养，镜检观察其形态特征。

(2)细胞核数目观察将直径为5 mm的待测菌饼接种到PDA培养基平板正中央，然后在菌饼周围插入6片已经高温灭菌的盖玻片，培养2～4天，待菌丝长到盖玻片2／3时取出，滴加番红0－KOH染色液，染色3—4 min(分)，每个玻片检测10个菌丝细胞的细胞核数。

(3)菌丝融合群的测定

将待测菌株PYY、ALS、PDX以及标准菌株AG1，在25℃条件下培养2天，用打孔器打取直径为5mm的菌饼，备用。于超净工作台内，在干净的载玻片上倒已灭菌的水琼脂培养基，培养皿内加入滤纸并以无菌水保湿，以灭菌的玻璃棒为支撑。挑取标准菌株AG1于载玻片正中央，两侧隔约2 cm分别放置同一待测菌株。每1菌株做3片，共6个重复，把载玻片放入培养皿中，25℃条件下培养，待2个菌落前缘在载玻片中央相遇并交叠2～3 mill后(需24～36小时)，取出载玻片，镜检。

(4)分子测定　对获得的PCR产物进行澳4序，与AGl标准菌株以及GenBank已登录的序列进行比对，通过同源性分析对病原菌进行鉴定。

2　结果与分析

2.1　发病症状

发病初期在苹果叶片上产生不规则黑斑，之后病斑逐渐扩大并连接成片，3～7天后叶片枯死，但不立即脱落。花芽受害后表现为芽鳞疏松，干枯死亡，不能正常开花结果；叶芽受害后不能正常发芽。病害严重时，发病部位树枝枯死。发病叶片及枝条上后期可见白色菌丝及黄白色菌核(图版2)，剖开越冬病花芽，其内组织变为黑褐色。在河南省北部7月上中旬开始发病，进入雨季发病严重，7月下旬至8月上中旬为发病高峰期，8月下旬以后病情发展较慢。

2.2　病原菌分离

从发病植株切取组织块或直接挑取菌核进行分离，自病芽分离获得菌株PYY。对不同苹果品种的不同发病部位进行分离，结果表明，从病叶、病枝、病芽均可以分离到病原菌。除部分标本可分离到单一病菌外，也分离到一些链格孢属真菌和细菌。但以立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Ktihn)的分离频率最高。

2.3　致病性测定结果

PYY菌株接种富士、新红星和乔纳金等苹果品种幼树叶片和枝条，结果表明，PYY菌株致病力较强。接种3天后，叶片上出现不规则黑斑；接种7天后，部分叶片干枯，表现为典型的叶枯症状。接种枝条发病率达100％，对照则不发病(图版2)。分离接种发病的枝条与叶片，得到与接种物相同的纯培养物。结果表明，分离得到的PYY菌株即为该病的病原菌。

2.4　病原菌形态特征

在PDA培养基上，菌株生长速度很快，3天后菌落直径可达9 cm，4天即可形成茵核。菌丝呈长绒毛状，初为白色，之后变为黄褐色。显微镜观察发现，菌丝粗壮，呈近直角分支，且分支处有明显缢缩，不产生分生孢子。菌核初为白色，之后变为黄褐色，表面粗糙，直径2～7 mm，形状不规则。

2.5　细胞核数目的测定及融合群观察

从20世纪60年代开始，细胞核数目的多少已作为区别立枯丝核菌及其类似菌双核丝核菌的重要标志之一。李华荣根据丝核菌细胞核的数目将丝核菌分为单核丝核菌、双核丝核菌以及多核丝核菌。采用番红O－KOH染色液染色，镜检发现菌丝细胞均为多核，细胞核数目3～9个，多为4～6个，属于多核丝核菌。融合群测定结果显示，菌株PYY与标准菌株AG1－IB融合，与菌株PDX及ALS为不完全融合，表现为菌株可以融合，但部分菌丝融合后有死亡现象。菌株PYY应为立枯丝核菌融合群AG1。

2.6　分子鉴定结果

选取菌株PYY与标准菌株AG1－IB以及AG1－IC，采用真菌通用引物ITSI／ITS4进行PCR扩增，并进行rDNA ITS的序列测定和分析。菌株的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，获得大小约700 bp的特异性片段，PCR产物序列测定获得692个碱基的核苷酸序列。菌株PYY与标准菌株AG1－IB、AG1－IC序列的同源性分别为99.2％、95.2％。

与GenBank中已有的DNA序列同源性比较结果显示，与其同源性最高的有5个ITS序列，其中3个菌株为Rhizoctonia solani Kahn(立枯丝核菌，GenBank登录号分别为FJ435105、EU730824、FJ492100)，同源性高达100％，另外2个序列的同源性也是100％，菌株为(水稻纹枯病病原菌，GenBank登录号分别为AJ868450、AJ868454)，即立枯丝核菌的有性型。结合形态学特点及分子鉴定的结果，菌株PYY为立枯丝核菌。

3　小结与讨论

苹果丝核菌叶枯病是发生在河南省苹果树上的一种新病害，接种试验表明，从病组织中分离出的病原菌对苹果叶片有较强的致病性，能够诱发出与田间自然发病相同的症状。结合形态学、与标准菌株的融合试验以及分子生物学方法，鉴定引起该病的病原菌为立枯丝核菌，所分离菌株，PYY属融合群AGl的融合亚群AG1－IB。

刘开启、张勇等曾报道山东地区的苹果树和桃树上发生了类似病害，研究发现病原菌均为立枯丝核菌。我们通过融合群测定，发现分离自河南省濮阳地区的菌株PYY与山东地区的菌株ALS以及PDX表现为不完全融合，即菌丝融合后发生死亡现象。这与山东自高青、东平不同果园分离的同种菌株之间可以发生菌丝融合，并发生杀死反应，属不完全型融合的情况相似。由于河南、山东二省相邻，病菌可能在这2个地区间相互传播，需要进行病害流行学分析，明确其关系。

立枯丝核菌寄主范围极广，可引起多种农作物发病。发生在河南省及山东省的叶枯病除了侵染苹果树、桃树之外是否还侵染其他果树，病菌的生物学特性及寄主范围等有待于进一步研究。此外，不同苹果品种之间抗性存在差异，新红星、红富士、乔纳金等苹果品种均可感病，松本锦表现出极高的抗性，田间防治时可选栽高抗品种，以提高抗病性。